黑龙江畜牧兽医投稿论文格式参考:猪精子性别控制技术研究进展

关键词： 猪; 性控精液; X/Y 精子分离技术; 精液质量; 精液分选

作者：张鸿岩;王善鹏;罗亚东;张伟静;闵令江;朱振东

作者单位：青岛农业大学;杭州东源生物科技有限公司

　　摘 要: 性别控制技术是指通过人为手段干预后，使母畜按照人们所希望的性别繁殖后代的技术。猪性控精液的生产 能够大大加快优良种猪选种选育的进程，为我国养猪业的可持续发展提供保障。本文系统综述了目前常见的猪精子 性别控制技术及保存方法，阐述了影响猪性控精液分选效率的原因及性别控制技术在养猪业的应用前景，为今后猪精 子性别控制技术的发展和应用提供参考。

　　我国是世界上公认的养猪大国，生猪生产是 我国农业的重要组成部分。我国生猪饲养量和猪 肉消费量均占全球总量的 50%以上，猪肉消费量 更是 占 据 全 国 肉 类 消 费 总 量 的 60% 以 上［1］。 2018 年我国发生非洲猪瘟，导致猪肉产量急剧下 降。随着稳产保供政策的有效实施，养殖场的产 能持续增长，生猪生产快速恢复，但我国猪肉市场 仍然面临着供需矛盾的问题［2］。为了解决这一问 题，科研人员不断研发新型技术，其中性别控制技 术是指人为干预后，使母畜生产出符合人们所期 望性别后代的技术手段［3］。性别控制技术在选种 选育中发挥重要作用，特别是对于优良种猪的培 育，通过选择特定性别的后代，加速遗传改良进 程，提高猪种的生产能力和抗病能力，推动我国养 猪业的稳定发展［4］。例如，市场对杜洛克公猪需 求量大，通常将杜洛克公猪作为终端父本，若能利 用性别控制技术分离 Y 精子用于人工授精，便能 快速获得优良纯正的杜洛克公猪。此外，性别控 制技术对扩大能繁母猪存栏量、调节种猪产仔性 别比例还具有重要的应用价值［5］。本文综述了目 前常见的猪精子性别控制技术及保存方法，探讨 了影响猪精子分选效率的因素，以及性别控制技 术在养猪业中的应用前景，旨在为今后猪精子性 别控制技术的发展和应用提供参考。

　　1 猪精子性别控制的方法

　　目前，国内对猪精子进行性别控制的方法也被称 为 X/Y 精子分选技术［6－7］。X/Y 精子分选技术是现 代动物繁殖和人类辅助生殖技术中的重要方法之一， 根据动物性染色体的差异分离出含 X 染色体或 Y 染 色体的精子，从而达到实现性别控制的目的［8］。X/Y 精子分选技术在畜牧业和医疗领域具有广泛应用，尤 其在提高家畜繁殖效率和控制性别比例方面具有重 要意义。目前，关注较多的 X/Y 精子分选方法包括 流式细胞仪分离法、pH 值分离法、磁性细胞分离法及 免疫学分离法［4，9］。

　　1. 1 流式细胞仪分离法

　　猪精子最常用的分选方法是流式细胞仪分离法。 该方法的原理是基于精子内 X 染色体和 Y 染色体在 DNA 含量上的微小差异。通常情况下，猪 X 染色体 比 Y 染色体大，X 精子相对于 Y 精子的 DNA 含量多 3. 6%［4］。流式细胞仪分离法利用这一差异，通过荧 光染料对精子进行染色，随后精子被置于流式细胞仪 流动室的鞘液中，通过窄流通道逐个通过激光束，激 发荧光染料，使其在特定波长下发出荧光。检测器则 根据荧光强度的差异区分 X/Y 精子，并通过电荷场 的偏转将其分离并收集［10］。曾有权等［11］使用流式 细胞仪分离法分离约克夏公猪的 X/Y 精子，其纯度 分别达到 88%、83%。流式细胞仪分离法分选的精子 虽然纯度较高，但是在分选过程中精子会经历荧光染 色、激光照射等过程，会对精子造成一定损伤［12］，且 使用流式细胞仪分离法分离精子产量低，速度慢，需 要专业技术人员操作，导致流式细胞仪分离法在生产 中难以广泛应用。

　　1. 2 pH 值分离法

　　猪精液一般呈现中性或弱碱性，pH 值在 7. 0 ～ 7. 5 之间。猪精子在不同的 pH 值环境下会表现出不 同的运动状态。在弱碱性环境中，X 精子的运动会受 到一定程度抑制，Y 精子的运动能力被激活; 在弱酸 性环境中，X 精子的运动能力被激活，Y 精子的运动 反而受到抑制。研究发现，猪精液在酸性溶液中的 X、Y 精子比例可达到 1. 2 ∶ 1，但这还不足以有效地 实现猪 X/Y 精子的分离［13］。胡冰艳等［14］研究发现， 在猪精液中添加一定浓度的水肌酸后，再利用 pH 值 分离法可以更高效地分离猪 X/Y 精子，在 pH 值为 6. 4 的精子稀释液中添加 750 μmol /L 的水肌酸时， 其上层精液 X 精子占比可达到 63. 32%; 在 pH 值为 7. 1 的精子稀释液中添加 750 μmol /L 的水肌酸时， 其上层精液 Y 精子占比可达到 67. 19%，且分选后不 会损伤精子质量。pH 值分离法分选精子较为方便且 节约成本，但目前 pH 值分离法仅在小规模的猪和奶 山羊养殖场中进行试验，要形成完善的体系还需多方 面的深入研究［15］。

　　1. 3 磁性细胞分离法

　　磁性细胞分离法是通过使用结合抗体的磁性微 粒特异性识别并结合精子表面与性别相关抗原的分 离方法［10］。当磁性微粒与精液混合后，通过磁场的 作用，便可以将带有特定性别标志的精子分离出 来［16］。K．Sringarm 等［17］通过磁场使用 Y 精子的特 异性单克隆抗体 scFV 耦联磁性微粒捕获 Y 精子后， 使 X 精子可被单独收集，而后通过添加洗脱液，再单 独收集 Y 精子。A．Johannisson 等［18］研究发现，通过 磁性细胞分离法分选出的猪精子相比于未分选的猪 精子会具有更高的膜完整性，其线粒体膜电位水平也 会更高，以此法分选出的猪精子也更有利于后续进行 人工授精。磁性细胞分离法操作简单，能够快速地在 不损伤精子的前提下以较高比例分选出 X/Y 精子， 虽然通过该方法分离得到的精子用于体外受精或人 工授精的研究较少，暂时无法确定其应用到生产中的 效果，但其仍有较好的研究前景。

　　1. 4 免疫学分离法

　　由于猪 X/Y 精子的基因组 DNA 存在差异，导致 其蛋白表达也不相同，免疫学分离法通过对某种精子 特异性表达的蛋白进行激活或抑制，从而实现分离 X/Y 精子，例如 Toll 样受体 7 /8( TLＲ7 /8) 只在 X 精 子中表达。T．Umehara 等［3］基于抗原抗体反应发现 了新的 X/Y 精子分离方法———激活 TLＲ7 和 TLＲ8 受体以分离 X/Y 精子。研究人员基于 TLＲ7 /8 受体 对 X 精子的作用进行了日本黑牛［15］和奶山羊［16］的 精子分离，其得到的 X 精子占比分别为 86. 2% 和 80. 3%，并将其用于体外受精后，雌性胚胎占比分别 为 84. 2%和 80. 5%。研究发现，猪精液中的 TLＲ7 和 TLＲ8 与特异性配体雷西莫特( Ｒ848) 共孵育后，发现 添加 Ｒ848 可抑制精子的糖酵解过程，降低猪 X 精子 的活力［19］。随着糖原合酶激酶 3α( GSK3α) 的磷酸 化水平的上升，导致 ATP 生成减少，使 X 精子运动速 度降低，在一定程度上降低高活力精子中 X/Y 精子 的比例，使精液上下层中 X/Y 精子含量出现差异，从 而实现 X/Y 精子的分离。吴昌华等［20］ 研究发现， TLＲ7 /8 在公猪 X/Y 精子中均有表达且表达模式无 显著差异，因此使用 Ｒ848 孵育后 X/Y 精子活力都受 到影响导致无法分离。目前免疫学分离法的相关研 究较少，但在日本黑牛和奶山羊的试验中证明，该方 法仍有很大的研究前景，有待进一步研究。

　　2 猪性控精液保存现状

　　在猪繁育体系不断发展的过程中，精液保存技术 是极为重要的一环，利用其可以更好地长期保存优良 种质资源［21］。性控精液的保存对于维持精子活力、 受精能力及后期性别选择的准确性至关重要。

　　在生产过程中，由于分选精子所需要的时间较 长，分选场所距输精地点较远等原因，性控精液往往 通过低温冷冻保存技术进行保存［22］。为了更好地保 存性控精液，精液分选后需要立即进行稀释。常用的 猪 性 控 精 液 稀 释 液 包 括 卵 黄 柠 檬 酸 盐 稀 释 液、 Modena 稀释液、ZO( zorlesco) 稀释液等，这些稀释液 能为精子提供必要的营养成分，维持精子内部 pH 值 和渗透压的稳定，保护精子膜的完整性［23］。此外，由 于猪性控精液需要冷冻保存，往往在稀释液中添加甘 油、二甲基亚砜、卵黄、牛血清白蛋白( BSA) 等冷冻保 护剂。冷冻保护剂可以抑制精子细胞内外冰晶的形 成，阻止细胞脱水和抑制细胞膜的相变等方式来降低冷冻对细胞的损伤［24－25］。猪性控精液分选后应尽快 冷却到 4 ℃ 左右，以减缓精子代谢，延长其存活时 间［19，26］。冷却过程中，设备的选择和冷却速度的控 制也需特别注意，确保温度变化平稳，需采用逐步降 温的方法，以防止温度骤变使精子产生冷应激，平衡 一段时间后再进行灌装并冷冻［27］。

　　3 影响猪精子分选效率及质量的因素

　　影响猪精子分选效率和质量的因素多种多样，但 大多可分为两类: 一类是由猪精子自身质量问题导 致，另一类则是由使用不同稀释液及不同分选技术、 操作条件等外在因素导致的。

　　3. 1 自身因素

　　有多种精子自身因素可以影响精子分选后的效 率和质量，主要包括精液质量、浓度及精液中是否存 在精浆。 精液质量是影响猪精子分选的基础因素。高质 量的精液意味着活精子数量更多，且精子活力强、畸 形率低，这对分选过程中的精子存活率和分选后的受 精能力至关重要，此外如果使用合适浓度的精液进行 性别分选也可以提高其分选效率［28］。猪精液质量受 公畜健康状况、营养水平、采精方法和频率等多种因 素的影响。因此，确保公畜健康和良好的饲养管理是 提高精液质量的关键。精液中精浆的存在同样会影 响精子分选过程，D．V．Alkmin 等［29］研究发现，猪精液 在采集后立即去除精浆可提高分选后精液的活精子 数及分选效率，但精浆具体是如何影响精子分选仍需 继续探究。

　　3. 2 外在因素

　　影响猪精子分选过程的外在因素主要是由分选 技术、操作条件和不同稀释液等因素所导致。 分选技术的选择和操作会直接影响猪精子的分 选效率及分选后质量。当前流式细胞仪分离法仍是 最常用的猪精子分选方法，然而该方法对设备要求 高、操作复杂，需要精确地控制和具有高技术水平的 操作员［30］。同时，分离过程中的激光照射和荧光染 料可能对精子造成一定的损伤，影响精子活力和受精 能力［12］。因此，优化分选参数，减少精子损伤，提升 设备的精准性和操作人员的技术水平，是提高分选后 精子质量及分选效率的重要手段。

　　操作条件也是影响猪精子分选过程的重要因 素［31］。在猪精子分选过程中，温度、pH 值和渗透压 的控制对精子的存活和分选效率有显著影响。精子 在适宜的温度和 pH 值环境下能够维持较高的活力 和功能。因此，在分选过程中，需要严格控制操作环 境稳定，确保精子在最适宜的条件下进行分选。此 外，分选过程中机器的流速和荧光染料的浓度也会对 分选效率产生很大的影响，需要精确控制，以保证精 子分离的准确性和效率［31］。W．M．Maxwell 等［32］研究 发现，用流式细胞仪进行猪精液分选前，使用合适的 稀释液也可以减轻精子在分选过程中受到的影响。

　　4 性别控制技术在养猪业中的应用

　　性别控制技术作为一项现代生物技术在养猪业中 展现出广阔的应用前景。性别控制技术主要应用于生 产实践，通过流式细胞仪分离法、pH 值分离法等方法 人为分离动物 X/Y 精子，最终得到所需性别的后代。 利用性别控制技术也可以准确控制猪群后代的性别比 例，加快育种进程，优化选种选育，尤其良种公猪的培 育［33］。此外，性别控制技术有助于建立优良品种基因 库，增强优良性状强度，最大限度地发挥优良猪种的遗 传优势，以此带来巨大的经济效益［34］。利用性别控制 技术还可以防止性染色体遗传病的发生和传播，通过 筛选和剔除带病的性染色体，尽量减少疫病的发生，从 而促进畜牧业的健康发展［35－36］。

　　近年来由于国家政策的推行，性别控制技术在我 国养猪业取得了重要进展，为提高生产效率、经济效 益、优化资源配置和满足市场需求提供了新的途 径［37］。尽管性别控制技术目前仍面临技术成本、操 作复杂性等挑战，但随着科技的不断发展，其应用成 本与操作门槛正逐渐降低。未来该技术有望通过精 确调控后代性别比例，推动我国养猪业向更精细和更 高效的方向发展，为行业带来更大的经济效益和社会 效益，同时为我国养猪业的可持续发展提供充足的 保障［38］。

　　5 总结与展望

　　性别控制技术在现代畜禽繁殖领域中具有重要 作用，其未来发展和应用前景也十分广阔。但到目前 为止，流式细胞仪分离法仍是唯一能有效实现性别控 制的商业化方法［39］。由于流式细胞仪设备昂贵，操 作要求严格，且分选速率较慢，使其难以广泛应用于 生产，也导致了市场上的性控精液价格较高等问题。 随着生物学技术的发展，在猪繁殖生产中，除了流式 细胞仪分离法、pH 值分离法等常见分选方法外，诸如 免疫学分离法、磁性细胞分离法等越来越多的新型分 选方法接连出现。其中磁性细胞分离法具有较好的 研究前景，目前虽然仍未建立一个完善的猪精子分选 体系，但随着对微流体和纳米技术的深入研究，此方 法也会逐渐改进发展，以期用于商业化的性控精液生 产，推动我国养猪业乃至整个畜牧业的发展。